L'hexokinase (EC 2.7.1.1) catalyse la réaction suivante : Glucose + ATP —. glucose-6-phosphate + ADP Dans les conditions retenues pour la mesure de son activité enzymatique, les Km respectifs de l''hexokinase pour le glucose et l'ATP sont tous les deux égaux à 0,1.10-3 M. · Questions : 1) Calculer la vitesse réactionnelle (en mol.min!.L- 2) en vérifiant que l'on est dans des conditions de vitesse initiale. 3) La vitesse initiale (vo) mesurée correspond-elle à la vitesse maximale (Vmax) ? Justifier. 4) Calculer la concentration en activité enzymatique (en U/L) contenue dans la préparation P. 405279 CES 5) La glucosamine est également un substrat de l'hexokinase. Le Km de l'hexokinase pour la glucosamine est de 1,5.10-8 M. Les activités moléculaires spécifiques de l'hexokinase sont respectivement de 80 6) Pour mesurer la vitesse de formation du glucose-6-phosphate dans l'expérience décrite dans l'énoncé, on utilise la réaction catalysée par la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD). a) Écrire la réa
Sciences de la vie
Mesure d'une activité enzymatique
Vitesse initiale, conditions optimales, unités et dosage spectrophotométrique.
01 · Pourquoi ce chapitre
Doser une enzyme, ce n'est pas peser une protéine : on mesure son activité catalytique, c'est-à-dire la vitesse de la réaction qu'elle catalyse. Encore faut-il que cette vitesse soit proportionnelle à la quantité d'enzyme — ce qui impose des conditions précises.
02 · La vitesse initiale
La vitesse se définit par la quantité de substrat consommé (ou de produit formé) par unité de temps :
On mesure la vitesse initiale (Vi), en tout début de réaction : le substrat n'a quasiment pas diminué, il n'y a pas encore de produit inhibiteur, et la vitesse est constante.
03 · Travailler à substrat saturant
La relation vitesse/substrat suit Michaelis-Menten :
- À faible [S] : V ∝ [S] (ordre 1), la vitesse dépend du substrat.
- À [S] saturante : V ≈ Vmax (ordre 0), indépendante de [S].
04 · Contrôler les conditions
L'activité dépend fortement du milieu ; on impose des conditions optimales :
- Température : l'activité croît jusqu'à un optimum (souvent 37 °C), puis chute par dénaturation.
- pH : optimum propre à chaque enzyme ; les valeurs extrêmes ionisent ou dénaturent le site actif.
- Force ionique et cofacteurs / activateurs (ions métalliques) présents en quantité adéquate.
05 · Les unités enzymatiques
- Unité internationale (UI) : quantité d'enzyme transformant 1 µmol de substrat par minute (en conditions optimales).
- Katal (unité SI) : quantité transformant 1 mol de substrat par seconde.
- Activité spécifique : UI par mg de protéine — elle mesure le degré de pureté d'une préparation.
06 · Le dosage spectrophotométrique
En pratique, on suit la réaction par spectrophotométrie, en mesurant l'absorbance selon la loi de Beer-Lambert :
07 · À retenir
- On mesure une vitesse initiale, proportionnelle à la quantité d'enzyme.
- Conditions : [S] saturante (ordre 0 → Vmax), T et pH optimaux.
- ; Km = [S] pour V = Vmax/2 (affinité).
- UI = µmol/min ; katal = mol/s ; activité spécifique = UI/mg (pureté).
- Dosage par Beer-Lambert, suivi du NADH à 340 nm.
QCM · épreuve 1
QCM
Q1. Une unité internationale (UI) d'enzyme correspond à…
Q2. Pour que la vitesse mesurée reflète la quantité d'enzyme présente, on travaille…
Q3. La constante de Michaelis Km correspond à la concentration en substrat pour laquelle…
Annales du concours sur ce thème
5 questions tombées au concours, portant sur ce chapitre. Voir toutes les annales →
La droite A de la figure ci-dessous représente les résultats d'une étude cinétique de l'activité d'une enzyme E sur son substrat S dans des conditions bien définies. 1/Vo (10Ëmol-*.L.min) 7 / Es 0,7 =. 08 ‘ pd # A — 04 4 A 0,2 sir 0,1 -6 5 -4 3 -2 -1 1/[S] (10#mol-*. · Questions : 1) a) Donner l'équation correspondant à cette droite (sans valeur numérique). b) Calculer le Km de l'enzyme pour son substrat. c) Calculer la Vmax. d) A quoi correspond la pente de cette droite ? Calcule 2) La droite B représente les résultats d'une cinétique obtenue dans les mêmes conditions mais en présence dans le milieu d'incubation d'un inhibiteur (!) à une concentration de [I] = 8 x 10-5 mol.L*. Da 3) Calculer la constante d'inhibition (Ki) de l'inhibiteur | pour l'enzyme E. 4) a) Calculer le pourcentage d'inhibition pour une concentration en substrat [S] = 10 Km et une concentration en inhibiteur [I] = 8 x 105 mol.L*. b) Quelle est l'évolution prévisible de ce pourcentage d 5) à une concentration de [1] = 8 x 1075 mol.L*. Da
LLeess2depuaxrtpiearstiAeseAt eBt sBosnotnitnidnédpépeennddaanntteess Partie A Enoncé Pour doser le pyruvate sérique, on le transforme totalement en lactate par réduction par la lactate déshydrogénase (LDH) en présence de NADH,H+ à pH 7,0. · Questions : 1) Ecrire la réaction catalysée par la LDH dans ce dosage. 2) Quelles sont les conditions à respecter concernant les concentrations en enzyme et en cofacteur dans ce dosage ? 3) Calculer la concentration en acide pyruvique dans le sérum en µmol.L-1 et en mg.L-1. Données : Masse molaire de l'acide pyruvique = 88 g.mol-1 Coefficient d'absorbance molaire du NADH,H+ à 340 nm = 63 4) Donner la définition de kcat. 5) Interpréter les effets provoqués par les substances A et B sur la cinétique enzymatique. Justifier.
On souhaite déterminer l'activité enzymatique de la lactate déshydrogénase (LDH, EC 1.1.1.27) contenue dans une solution d'extrait de tissu musculaire partiellement purifié. · Questions : 1) Quels sont les composants présents dans le réactif ? Quelles sont les conditions liées à leurs concentrations respectives ? 2) Justifier le choix de la longueur d'onde pour réaliser les mesures d'absorbance. Préciser le sens de variation de l'absorbance à cette longueur d'onde. 3) Calculer la concentration en activité LDH (en U/L) contenue dans le milieu réactionnel et dans la solution d'extrait tissulaire partiellement purifié. On donne le coefficient d'absorbance linéique mol 4) Pour obtenir l'extrait tissulaire partiellement purifié, on est parti de 50 mL d'une solution centrifugée d'un homogénat initial ayant une concentration catalytique en LDH de 8300 U/L et contenant 15, 5) Préciser la structure macromoléculaire des isoenzymes de la LDH. Quelle est l'isoenzyme qui prédomine dans le muscle squelettique ? Quelle est l'isoenzyme qui prédomine dans le muscle cardiaque ?
La glutamate déshydrogénase (GLDH, EC 1.4.1.3) catalyse la réaction suivante : α-cétoglutarate + NH4+ + NADPH,H+ <------> glutamate + H2O + NADP+ On utilise la GLDH pour doser la concentration en ion ammonium dans le plasma. · Questions : 1) En considérant l'équation de Michaelis-Menten, préciser les conditions (théorique et pratique) à respecter pour que la vitesse soit d'ordre 1 par rapport à la concentration en substrat S. 2) Quelle est l'absorbance théorique au temps t = 0 (après addition de la GLDH), sachant que le coefficient d'extinction molaire (coefficient d'absorbance linéique molaire) du NADPH,H+ à 340 nm est de 63 3) Sachant que dans les conditions du dosage, les Km de la GLDH pour l'α-cétoglutarate et le NADPH,H+ sont respectivement de 0,5 mM et 0,012 mM, exprimer les concentrations de ces réactifs (en unités Km) 4) En prenant comme limite supérieure de validité du dosage une concentration en ion ammonium dans la cuve réactionnelle inférieure à 0,1 Km, quelle serait la valeur maximale de la concentration en ammon