Méthodes d'identification des mutations délétères

La PCR (polymerase chain reaction) amplifie in vitro une courte séquence encadrée par deux amorces (oligonucléotides d'environ 20 nucléotides, extrémité 3'OH libre), grâce à une ADN polymérase thermostable (Taq), en présence de dNTP et de Mg²⁺.

Chaque cycle comporte trois étapes :

• dénaturation par la chaleur (séparation des deux brins) ;
• hybridation des amorces sur les séquences flanquantes ;
• élongation dans le sens 5'→3'.

L'amplification est exponentielle. On peut amplifier de l'ARN après transcription inverse (RT-PCR).

La méthode enzymatique de Sanger synthétise, à partir d'un ADN simple brin et d'une amorce, de nouveaux brins en présence de dNTP et d'une faible quantité de ddNTP (didésoxyribonucléotides, dépourvus de groupement 3'OH). L'incorporation d'un ddNTP arrête l'élongation.

On obtient une collection de fragments de tailles croissantes, séparés à un nucléotide près par électrophorèse. Les ddNTP sont marqués par quatre fluorochromes, lus par un laser sous forme d'électrophorégramme. C'est la référence pour détecter substitutions, petites délétions et insertions.

Le séquençage haut débit (NGS) analyse en parallèle de nombreux gènes (panels, exome, génome entier) et complète aujourd'hui largement Sanger, réservé à la validation ciblée.

Toutes ces techniques reposent sur l'hybridation moléculaire d'une sonde marquée avec sa séquence complémentaire.

• Southern blot : analyse d'un fragment d'ADN au sein du génome, après digestion par des enzymes de restriction (endonucléases bactériennes), électrophorèse, transfert sur membrane et hybridation. Met en évidence délétions, insertions, remaniements.
• Northern blot : dérivé, adapté à l'analyse d'un ARN messager (taille des transcrits, épissage alternatif).
• FISH (hybridation in situ fluorescente) : sonde fluorescente repérant une séquence sur un chromosome (chromosome entier, bras, bande ou locus).

• Microsatellites (CA)n : multi-alléliques, étudiés par PCR puis électrophorèse.
• SNP : étudiés par PCR/RFLP (digestion par une enzyme de restriction créant ou abolissant un site), PCR spécifique d'allèle ou PCR/séquençage.
• CGH-array : analyse globale du génome détectant les variations quantitatives d'ADN (aneuploïdies, délétions, duplications, CNV). Elle ne détecte pas les translocations réciproques ni les inversions équilibrées (pas de gain ni de perte).

• Diagnostic direct : recherche directement la mutation dans le gène. Conditions : gène identifié. Résultat de quasi-certitude, possible même pour un cas sporadique.
• Diagnostic indirect : suit la ségrégation de marqueurs polymorphes (microsatellites) liés au locus morbide. Réservé aux formes familiales, avec diagnostic clinique certain ; résultat probabiliste, limité par l'informativité des marqueurs et les recombinaisons.

• PCR : Taq thermostable, deux amorces, cycles dénaturation-hybridation-élongation ; RT-PCR pour l'ARN.
• Sanger : ddNTP terminateurs, lecture par fluorescence, détecte substitutions et petits indels.
• Southern (ADN), Northern (ARN), FISH (chromosome) reposent sur l'hybridation moléculaire.
• CGH-array : anomalies quantitatives et CNV, mais pas les remaniements équilibrés.
• Diagnostic direct (mutation) versus indirect (marqueurs liés, formes familiales).