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Sciences mathématiques, physiques et chimiques

Spectrofluorimétrie

Racym Berrah, PharmD Internat Pharma Dernière révision : 9 juillet 2026 ORCID

Mesurer la lumière réémise par une molécule excitée : une méthode très sensible et sélective.

01 · Pourquoi ce chapitre

Certaines molécules, après avoir absorbé de la lumière, en réémettent une partie : elles fluorescent. Mesurer cette émission est beaucoup plus sensible que mesurer une absorption — d'où l'usage de la fluorimétrie pour les traces et l'immunoanalyse.

02 · Principe

La molécule absorbe un photon d'excitation et passe à un état excité. Elle perd d'abord un peu d'énergie sans rayonner (relaxation vibrationnelle), puis retombe à l'état fondamental en émettant un photon.

03 · Intensité et sensibilité

Pour une solution diluée, l'intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration et à l'intensité de la source :

F=k Φ I0 ε l CF = k\,\Phi\,I_0\,\varepsilon\,l\,C

Φ\Phi est le rendement quantique (photons émis / absorbés).

04 · Appareillage

Source intense (lampe xénon), monochromateur d'excitation, cuve, puis monochromateur d'émission et détecteur placés à 90° du faisceau incident (pour ne pas recevoir la lumière transmise). Deux monochromateurs, donc double sélectivité : λexc\lambda_{exc} et λem\lambda_{em}.

05 · Facteurs et limites

  • Fluorophores : molécules rigides, planes, aromatiques conjuguées (quinine, fluorescéine).
  • Extinction (quenching) : collisions, oxygène, température ; à forte concentration, auto-extinction qui rompt la linéarité.
  • Milieu : le pH, la polarité du solvant et la viscosité modifient l'intensité et le spectre de fluorescence.
  • Applications : dosage de traces, immunoessais fluorescents, détection en CLHP et électrophorèse capillaire, analyse chirale après dérivation fluorescente.

06 · Piege classique

07 · À retenir

  • Excitation puis émission ; λem>λexc\lambda_{em} > \lambda_{exc} (Stokes).
  • FF proportionnelle à CC et à I0I_0 ; méthode très sensible.
  • Détection à 90°, deux monochromateurs.
  • Linéarité limitée aux solutions diluées (auto-extinction).

QCM · épreuve 1

QCM

Q1. En fluorimétrie, la longueur d'onde d'émission est…

Q2. Le détecteur de fluorescence est placé…

Q3. Comparée à l'absorption UV, la fluorimétrie est…

Annales du concours sur ce thème

3 questions tombées au concours, portant sur ce chapitre. Voir toutes les annales →

QCM n°60 Décembre 2023

Parmi les propositions suivantes concernant la spectrofluorimétrie moléculaire, lesquelles sont exactes ?

  1. ALe rendement quantique augmente avec la conjugaison électronique du fluorophore
  2. BLa durée de vie de fluorescence excède la seconde
  3. CLe phénomène de fluorescence fait intervenir le niveau triplet excité (T1) du fluorophore
  4. DL'intensité de fluorescence augmente avec la planéité du fluorophore
  5. EEn solution très diluée, l'intensité de fluorescence est directement proportionnelle à la concentration de la substance fluorescente
QCM n°19 Décembre 2021

Parmi les propositions suivantes concernant la spectrofluorimétrie moléculaire, quelles sont les propositions exactes ?

  1. ALe rendement de fluorescence d'un composé varie en fonction du solvant
  2. BLa longueur d'onde d'émission est supérieure à la longueur d'onde excitatrice
  3. CTous les composés qui absorbent la lumière UV-visible ont des propriétés de fluorescence
  4. DLe déplacement de Stokes est une caractéristique importante du composé fluorescent
  5. ELa source lumineuse doit être la moins énergétique possible
QCM n°25 Décembre 2017

Parmi les propositions suivantes concernant les méthodes spectrales, quelles sont celles qui sont exactes ?

  1. ALa lampe à filament de tungstène émet un rayonnement de longueurs d'onde supérieures à 350 nm
  2. BLa fluorescence est un phénomène plus rapide que la phosphorescence
  3. CL'augmentation de la température de l'échantillon augmente l'intensité de la fluorescence
  4. DLe rendement quantique correspond au rapport du nombre de photons absorbés sur le nombre de photons émis
  5. EEn fluorimétrie, l'effet RAMAN correspond à la diffusion de la lumière par le solvant

Sources

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Berrah R. Spectrofluorimétrie. Internat Pharma, 2026. https://rberrah.github.io/internat/chapitres/i-4-spectrofluorimetrie/

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Contenu pédagogique original · CC BY-SA 4.0 — réutilisable, y compris en enseignement, à condition de citer l'auteur et de partager aux mêmes conditions. Le code du site reste sous licence MIT. Écrit et maintenu par Racym Berrah, PharmD, doctorant en pharmacologie · ORCID · Une erreur ? Signalez-la
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